Рис. 1. Универсальный метод исследования раковых опухолей, разработанный в рамках обсуждаемого исследования. Материал из биопсии опухолей пациентов трансплантировали ортотопно (то есть в аналогичный орган) иммунодефицитным мышам и получали ксенографтные (то есть с тканью, пересаженной от организма другого вида — в данном случае от человека) опухоли (PDX, patient-derived xenograft). Затем выросшие у мышей опухоли анализировали по гистологии с помощью электронной микроскопии, секвенировали их геномы и количественно определяли набор мРНК. Клетки ксенографтных опухолей можно хранить в замороженном виде, чтобы использовать в дальнейших работах. Особенно важно, что авторы создали централизованный репозиторий, доступный для других исследователей. Рисунок из популярного синопсиса к обсуждаемой статье в Nature

Ученые получили и охарактеризовали 67 ортотопных трансплантатов 12 типов детского рака, а также показали, что они сохраняют основные свойства исходной опухоли. Результаты работы и полученные клеточные культуры представлены в хранилище данных, открытом для пользования другими исследователями. Попутно выяснилось, что вещество AZD1775 — ингибитор протеинкиназы WEE1 — эффективно против рабдомиосаркомы. Разработанная система сравнительно недорога и может быть использована для исследования раковых опухолей человека, а также для быстрого подбора средств лечения рака и доклинических испытаний новых противораковых препаратов.

Изучением рака занимаются в тысячах лабораторий в разных странах мира. Иногда происходят курьезные случаи, когда вследствие, например, путаницы или загрязнения клеточных культур другими клетками ученые работают совсем не с теми раковыми клетками, которые требуются. Полученные результаты приходится отправлять в мусорную корзину, а немалые затраты на них оказываются напрасными. Всё более очевидно, что нужна унификация и стандартизация исследований онкологических заболеваний: они должны проводиться по одним протоколам, на достоверно охарактеризованном и проверенном материале. Для этого скоординированными усилиями различных институтов и лабораторий создаются репозитории (хранилища данных) детально описанных и проверенных клеток с возможностью быстрого доступа к этим базам данных.

Хотя средняя выживаемость детей с солидными опухолями (см. Solid tumor) составляет более 75%, среди детей с рецидивами выживают уже менее 30%. База данных с описанием различных видов таких опухолей, особенно редко встречающихся, должна помочь созданию новых моделй рецидивов.

Авторы статьи в журнале Nature разработали систему, позволяюшую адекватно воспроизводить раковые опухоли детей на модельных мышах. В течение 2010–2015 годов они брали свежие образцы ткани опухолей и метастазов у 225 детей и детально исследовали их, сравнивая с образцами нормальных тканей этих пациентов. 148 образцов были введены иммунодефицитным мышам с целью получить у них ортотопные (в таких же органах, как у больного) ксенографтные (чужеродные, с тканью, пересаженной от больных детей) опухоли (orthotopic patient-derived xenografts, рис. 2). Опухоли, развившиеся у мышей, сравнивали затем с опухолями пациентов.

Рис. 2. Расположение самых распространенных из исследованных типов рака в теле человека и мыши (нейробластома, остеосаркома, рабдомиосаркома, ретинобластома, опухоль Вильмса, саркомы Юинга). Рисунок из обсуждаемой статьи в Nature

Во многих предшествующих исследованиях было показано, что именно при ортотопной трансплантации (в отличие от часто используемой трансплантации под кожу) наилучшим образом сохраняются свойства пересаживаемых клеток.

Всего пересаживали клетки опухолей 15 различных типов: нейробластомы (41 образец), остеосаркомы (31), рабдомиосаркомы (20), ретинобластомы (10), опухоли Вильмса (9), десмопластического круглоклеточного рака (9, см. Desmoplastic small-round-cell tumor), саркомы Юинга (7), высоко-злокачественных сарком (6), адренокортикальной карциномы (5). Кроме того были сделаны 10 пересадок шести типов других очень редких раков. Клетки различных опухолей приживались с разной степенью эффективности (в среднем — 45%). Всего получено 67 образцов ортотопных ксенографтных опухолей 12 различных типов рака (рис. 3). Можно было получить из них культуры клеток, проводить с ними генетические манипуляции, замораживать для хранения, использовать их для повторной трансплантации мышам.

Рис. 3. Эффективность ортотопной имплантации клеток различных опухолей иммунодефицитным мышам. DSRCT — десмопластический круглоклеточный рак, EWS — саркома Юинга, HGS — высоко-злокачественные саркомы, NB — нейробластома, OS — остеосаркома, RB — ретинобластома, RMS — рабдомиосаркома, WT — опухоль Вильмса. Рисунок из обсуждаемой статьи в Nature

Клетки из полученных опухолей мышей опять подвергались детальному исследованию, и результаты сопоставляли с соответствующими характеристиками образцов от пациентов. По данным иммуногистологического исследования, 48 из 49 опухолей мышей были практически идентичны соответствующим опухолям больных. Электронная микроскопия 36 исследованных ксенографтных опухолей показала наличие во всех них тех же внутриклеточных и межклеточных структур, что и в исходных опухолях.

С целью выяснить, сохраняют ли ксенографтные опухоли соматические мутации исходных опухолей было проведено полное секвенирование геномов и кодирующих последовательностей (экзомов) 51 пары «ксенографтная опухоль/исходная опухоль». В некоторых редких случаях в ксенографтной опухоли обнаруживались мутации, отсутствующие в исходной, и наоборот. Это могло быть связано с тем, что в разных частях опухоли могут происходить разные мутации —гетерогенность опухолей уже достаточно хорошо известна, а также — с загрязнением ткани опухоли нормальной тканью. В общем же набор мутаций в ксенографтных опухолях хорошо соответствовал их набору в исходных опухолях. При повторных трансплантациях «ксенографтные» клетки продолжали эволюционировать и медленно накапливать новые мутации, но их основной исходный набор сохранялся. Количественное определение наборов мРНК продемонстрировало, что профили экспрессии генов сохраняются и в ксенографтных опухолях. Преципитация хроматина с антителами против ряда гистонов с последующим секвенированием защищенных этими гистонами участков ДНК показала, что «ксенографтные» клетки сохраняют наборы открытых и закрытых для экспрессии генов, свойственных исходным опухолям. Иными словами, свойства опухолей сохранились и на эпигенетическом уровне.

Чтобы определить чувствительность ксенографтных опухолей разных типов к лекарственным средствам, из 30 из них были получены культуры клеток, которые испытали на чувствительность к 156 терапевтическим препаратам. Среди испытанных соединений особый интерес представляло еще не одобренное к применению в клинике для лечения рабдомиосаркомы химическое соединение AZD1775. Это ингибитор WEE1 — одного из ключевых регуляторов роста клетки. AZD1775 эффективно подавляло рост клеток в культурах. Затем клетки из ксенографтной рабдомиосаркомы пометили геном люминесцентного белка люциферазы, и после ортотопной трансплантации мышам наблюдали эффект от лечения комбинациями различных препаратов. Наилучший результат был получен в случае комбинации иринотекан + винкристин + AZD1775 (рис. 4).

Рис. 4. Доклинические испытания с использованием мышиной модели ксенографтных опухолей. Мышей лечили от привитой им рабдомиосаркомы различными противоопухолевыми веществами (сокращения: IRN — иринотекан, VCR — винкристин). По флюоресценции люциферазы можно судить об успешности разных комбинаций веществ: PD –заболевание спрогрессировало, PR — частичное сокращение опухоли, CR — опухоль не обнаружена. Рисунок из обсуждаемой статьи в Nature

Эта комбинация оказалась и более выигрышной с точки зрения выживаемости мышей в сравнении со стандартной для лечения этого заболевания комбинацией иринотекан + винкристин и применением только AZD1775 (рис. 5).

Рис. 5. Выживаемость мышей при лечении привитой им рабдомиосаркомы различными противоопухолевыми соединениями. Рисунок из обсуждаемой статьи в Nature

Техника получения ортотопных ксенографтных опухолей уже достаточно хорошо отработана, трансплантация обычно проходит вполне успешно. Методы, описанные в обсуждаемой статье, сравнительно просты и дешевы, и их применение, а также созданный доступный без требований соавторства и бесплатный для других исследователей репозиторий, могут существенно продвинуть изучение рака во многих лабораториях, позволяя быстрее и с меньшими затратами разрабатывать новые средства лечения рака.

Самое значимое достоинство описанного подхода — сравнительно простое создание образцов для дальнейшего исследования без потери свойств опухоли. Что особенно ценно, можно создавать модели для подбора средств лечения раков, для которых пока нет генно-инженерных мышиных линий. В лабораториях уже имеется примерно 1000 ксенографтных моделей «твердых» и гематологических раков детей и взрослых. Авторы обсуждаемой работы внесли существенный вклад в такие исследования, создав еще 148 детских раков, в том числе и очень редких.

Важно, что впервые был проведен детальный анализ ксенографтных опухолей, показавший высокую степень их сходства с исходными опухолями. Повторная трансплантация замороженных «ксенографтных» клеток также показала высокую степень сходства вторичных опухолей с исходными. Консорциум Childhood Solid Tumour Network, членами которого являются авторы обсуждаемой работы, уже предоставил доступ к рапозиторию более чем 120 лабораториям в 11 странах. В дальнейшем активность этого и других консорциумов, вероятно, будет развиваться, репозитории будут расширяться, а новые ксенографтные модели будут появляться по стандартизованным методикам.

Источник: elementy.ru