Рис. 1. Искусственные эмбрионы, сконструированные из клеток двух типов. Окрашивание выявляет характерные для клеток маркеры. На изображении a зеленым окрашен NANOG — маркер плюрипотентных клеток, которые потом дадут все ткани зародыша, красным окрашен F-актин, который присутствует во всех клетках. На изображении b зеленым окрашен OCT4 — еще один маркер плюрипотентных клеток, красным окрашен F-актин. На изображении c зеленым окрашен CDX2 — маркер внезародышевых тканей, — необходимый для формирования плаценты. Длина масштабных отрезков — 50 мкм. Изображение из обсуждаемой статьи N. C. Rivron et al. в Nature

В мае в журнале Nature вышли две статьи, посвященные моделированию зародышей. Авторы первой из них сконструировали эмбрион из отдельных клеточных слоев, чтобы отследить их взаимодействие при имплантации. Авторы второй воспроизвели в культуре стволовых клеток возникновение зародышевых листков — один из ключевых процессов эмбриогенеза. Ни в одном из экспериментов не был получен жизнеспособный эмбрион, но этих моделей достаточно для изучения отдельных процессов зародышевого развития.

Раннее развитие млекопитающих — одна из самых загадочных областей эмбриологии, в которой пока еще остается много нерешенных вопросов. Например, до конца XX века исследователи не могли определиться даже с тем, в какой плоскости проходят первые деления клеток после оплодотворения. Всё потому, что зародыши очень сложно изучать. Во-первых, из-за особенностей развития: оно может происходить только в организме матери. Только недавно технологии искусственного оплодотворения позволили наблюдать in vitro за первыми днями эмбриогенеза млекопитающих, но к моменту имплантации зародыш всё равно приходится подсаживать в матку. Во-вторых, этические принципы ограничивают эксперименты на зародышах человека, так что даже имплантацию пронаблюдать нельзя. К тому же, всегда есть риск, что зародыши, полученные в результате экстракорпорального оплодотворения, будут чем-то отличаться от «естественных» зародышей (например, если у донорских половых клеток были какие-то аномалии).

Меж тем первые две недели развития эмбриона человека (да и вообще, начальные стадии развития эмбриона любого млекопитающего) насыщены драматическими событиями (рис. 2).

Рис. 2. Схематическое изображение ранних событий эмбриогенеза человека. Все пояснения — в тексте. Рисунок с сайта en.wikipedia.org

Сначала в течение двух дней идет дробление — серия быстрых неупорядоченных делений, в ходе которых из оплодотворенной яйцеклетки формируется рыхлое скопление клеток. В процессе дробления активируется собственный геном зародыша: клетки начинают сами производить РНК и белки и перестают пользоваться «наследством» яйцеклетки.

На третий день это скопление сжимается, происходит компактизация. На этом этапе между клетками возникают плотные контакты, не пропускающие воду в межклеточное пространство. За компактизацией следует первая дифференцировка — клетки снова делятся, при этом их потомки, оставшиеся снаружи эмбриона, наследуют клеточные контакты, а оказавшиеся внутри образуют новую рыхлую массу.

На пятый день начинается кавитация — внешние клетки прокачивают сквозь себя воду внутрь, а наружу сквозь клеточные контакты она выйти не может. В результате вода накапливается внутри и клеточный шар раздувается. Формируется бластоциста — структура, аналогичная бластуле других позвоночных животных. Наружный слой называют трофобластом, он впоследствии образует внезародышевые ткани (плаценту и зародышевые оболочки). Внутри него лежит внутренняя клеточная масса, ей предстоит дать начало всем собственным тканям зародыша.

Ближе к концу первой недели бластоциста выходит из оболочки оплодотворения (углеводного слоя, который сначала защищал оплодотворенную яйцеклетку от других сперматозоидов, а потом бластоцисту — от воздействий внешней среды). И примерно на седьмой день происходит имплантация (см. Implantation) — встраивание зародыша в стенку матки. При этом трофобласт врастает в эндометрий (внутренний слой стенки), и его клетки сливаются в многоядерную структуру. Матка на это отвечает децидуальной реакцией — ее клетки тоже делятся и накапливают питательные вещества, в стенке усиливается рост сосудов.

Дальнейшие события визуализировать сложно, так как геометрия зародыша млекопитающих — довольно необычная по сравнению с другими позвоночными. Внутренняя клеточная масса расслаивается на два пласта — эпибласт и гипобласт, при этом зародыш похож на вогнутую чашу (верхний слой — эпибласт — внутри). К концу второй недели развития клетки эпибласта мигрируют в пространство между слоями, формируя средний слой — мезодерму. Этот процесс называют гаструляцией.

Эмбриолог Льюис Уолперт писал: «Не рождение, супружество или смерть, а гаструляция на самом деле является наиважнейшим событием в нашей жизни». Действительно, в ходе гаструляции закладывается план строения тела, то есть относительное расположение его частей и тканей. Место начала гаструляции станет спинной и задней частью организма. Там возникает клеточная борозда (первичная полоска), сквозь которую клетки могут мигрировать внутрь, образуя мезодерму. Борозда движется сзади вперед, а клетки продолжают сквозь нее подворачиваться. В глубине борозды находится зародышевый организатор — группа клеток, которая выделяет вещества, определяющие судьбы окружающих клеток (см.: Обнаружено фундаментальное сходство между развитием актинии и развитием позвоночных, «Элементы», 02.06.2016). Организатор побуждает клетки, проходящие через него, становиться мезодермой. А мезодерма, в свою очередь, действует на верхний слой клеток, стимулируя их превращение в нервную систему. В результате закладываются основы строения хордового животного: сверху — нервная трубка, ниже — хорда и другая мезодерма. Спереди — головной мозг и рот, сзади — анальное отверстие.

Первая из обсуждаемых статей из майских номеров журнала Nature посвящена созданию искусственной бластоцисты. Ее авторы работали с эмбрионами мыши. Они брали настоящие бластоцисты, забирали из них клетки трофобласта и внутренней клеточной массы и выращивали их отдельно. Так ученые получали отдельные культуры эмбриональных стволовых клеток (из внутренней клеточной массы) и стволовых клеток трофобласта. Эмбриональные стволовые клетки отбирали группами по пять клеток и растили отдельно, чтобы они формировали комочки. Затем их накрывали слоем клеток трофобласта. В результате получались бластоиды — структуры, напоминавшие по строению бластоцисту (рис. 3).

Рис. 3. Дизайн эксперимента с бластоидами. Из бластоцист получали культуры эмбриональных стволовых клеток (ES cells) и стволовых клеток трофобласта (TS cells), а затем совмещали их обратно. Красным обозначена внутренняя клеточная масса, зеленым — трофобласт. Изображение из обсуждаемой статьи N. C. Rivron et al. в Nature

Рис. 4. Имплантация бластоидов в матку мыши. Синим окрашены места повышенной проницаемости сосудов — признак децидуальной реакции. Белыми стрелками указаны места имплантации бластоидов. Красная стрелка указывает на яичник. Изображение из обсуждаемой статьи N. C. Rivron et al. в Nature

Клеточный состав бластоидов соответствовал слоям бластоцисты по экспрессии маркеров (рис. 1). При инъекции как стволовых клеток трофобласта, так и эмбриональных стволовых клеток в настоящие мышиные бластоцисты они встраивались в зародыши и участвовали в формировании тканей. Это позволяет заключить, что на уровне отдельных клеток бластоиды аналогичны бластоцистам. При подсаживании мышам бластоиды имплантировались в матку, трофобласт разрастался и вызывал децидуальную реакцию (рис. 4). Однако полноценного развития зародышей не происходило. Таким образом, можно говорить о том, что трофобласт в искусственных эмбрионах функционирует полноценно, а вот внутренней клеточной массе для начала дифференцировки чего-то не хватает.

Тем не менее эта модель позволяет изучать сигналы, необходимые для имплантации эмбрионов. Например, можно проверить, какую роль играет внутренняя клеточная масса в регуляции работы трофобласта. Авторы статьи пробовали образовать бластоиды с помощью других клеточных типов, среди которых были эмбриональные стволовые клетки человека и фибробласты обезьяны. С этими клеточными типами бластоиды практически не формировались, эффективны оказались только собственные эмбриональные стволовые клетки. Дальше можно проверять, какие именно сигналы посылает внутренний слой трофобласту. Например, вырастить эмбриональные стволовые клетки, нокаутированные по сигнальным белкам. Так, нокаут по белку Nodal снижал способности клеток образовывать бластоиды, а у немногих сформировавшихся хуже прошла кавитация. На основе подобных экспериментов авторы вывели список сигналов, которые получает трофобласт (рис. 5).

Рис. 5. Сигналы трофобласту от внутренней клеточной массы, приводящие к имплантации. Разными цветами написаны названия белков, под ними — сигнальные пути, которые они запускают. Слева — сигналы деления и обновления, справа — созревания и морфогенеза. Изображение из обсуждаемой статьи N. C. Rivron et al. в Nature

Авторы второй статьи работали с более поздними стадиями развития. Поскольку работа с эмбрионами человека затруднена (а их интересовал именно человек), они использовали культуру эмбриональных стволовых клеток человека. Известно, что если выращивать их на подложке правильной формы и действовать на них белком BMP4, они образуют гаструлоиды — концентрические круги из клеток разных типов (то есть под действием этого белка происходит дифференцировка). В центре оказывается эктодерма (наружный, верхний слой), снаружи — внезародышевые ткани, а мезо- и энтодерма располагаются посередине (см. A. Warmflash et al., 2014. A method to recapitulate early embryonic spatial patterning in human embryonic stem cells). Идентифицировать эти типы клеток можно по характерным маркерам (рис. 6).

Рис. 6. Клеточные слои в гаструлоидах, образованных под действием белка ВМР4 и его ингибиторов (SB, IWP2). Слева: синим окрашена эктодерма (в роли маркера — белок SOX2), красным — мезодерма (белок BRA), зеленым — внезародышевые ткани (белок CDX2). Справа: синим окрашены клеточные ядра (краситель DAPI), желтым — энтодерма (белок SOX17). Изображение из обсуждаемой статьи I. Martyn et al. в Nature

Но раз в культуре эмбриональных стволовых клеток возможна гаструляция, то где-то должен быть организатор — та самая группа клеток, запускающая дифференцировку тканей. Эти клетки под действием белка ВМР должны выделять свое сигнальное вещество, в роли которого у других млекопитающих (кроме человека) выступает белок Nodal.

В гаструлоидах человека тоже удалось найти такую группу клеток. Чтобы подтвердить, что они могут быть зародышевым организатором, их подсадили в куриный эмбрион. Если они действительно выделяют универсальный белок Nodal, то клетки куриного эмбриона будут на него реагировать и сформируют еще одну ось тела (с хордой, нервной трубкой и т. д.). Эксперимент подтвердил предположение: вторая ось формировалась, и клетки человека принимали в этом непосредственное участие (рис. 7).

Рис. 7. Эксперимент с подсаживанием человеческого зародышевого организатора в эмбрион цыпленка. a — схема эксперимента, пересадку осуществляют специально сбоку от оси эмбриона, чтобы их легко было отличить. На фото h показан результат пересадки, слева — собственная ось цыпленка, справа — красные клетки человека. s–v — РНК-гибридизация, выявляющая работу генов как в основной оси (справа), так и в короткой дополнительной (слева). На фото s окрашен маркер нервной трубки SOX3, на фото t — маркер переднего мозга OTX2 (отсутствует во второй оси), на фото u, v — маркеры задних отделов нервной трубки HOXB1 и GBX2. Длина масштабных отрезков — 500 мкм. Изображение из обсуждаемой статьи I. Martyn et al. в Nature

Итак, ученым удалось создать искусственную бластоцисту млекопитающих, а также модель гаструлы, собранную из стволовых клеток. Первая способна имитировать процессы имплантации, вторая — формирование плана строения тела. А значит, наконец-то открыта дверь в экспериментальную эмбриологию человека.

Источник: elementy.ru