Рис. 1. Происхождение, строение и экспрессия генов семейства Notch2NL. А — общая история происхождения семейства генов Notch2NL (которое и оказалось в центре внимания). Оно возникло у человекообразных приматов путем сначала дупликации гена рецептора Notch2 в той же хромосоме, а затем еще нескольких дупликаций новообразованного гена. Только у представителей человеческой линии эти гены оказались функциональными, то есть обеспечивали синтез белка. У горилл и шимпанзе это всего лишь псевдогены — «мусорная ДНК». В — доменная организация белка рецептора Notch2 и белков семейства Notch2NL, возникших в результате дупликаций. Розовым обозначены повторяющиеся мотивы, схожие с последовательностью белка эпидермального фактора роста (EGF). Эти мотивы образуют основную часть внеклеточного домена рецептора и по шесть таких мотивов составляют каждый белок Notch2NL. Желтым кружком обозначен сигнальный пептид (он предопределяет синтез белка на шероховатой эндоплазматической сети и присутствует у большинства секретируемых белков) — видно, что у генов А и С этот мотив отсутствует. С — экспрессия генов семейства Notch2NL, которая измерялась в разных зонах мозга абортивных зародышей человека на разных стадиях. Видно, что ген В экспрессируется заметно активнее других генов из этого семейства. Рисунки из обсуждаемых статей в Cell

Сразу два коллектива ученых опубликовали статьи с результатами своих исследований генетических механизмов работы мозга. Было обнаружено, что вся история начинается с дупликации гена Notch2, кодирующего важнейший мембранный белок-рецептор, играющий роль в передаче сигналов между соседними клетками и в регуляции процессов деления/дифференцировки нейронов в мозге эмбриона. Дупликация первоначально произошла у общего предка человека, гориллы и шимпанзе, но на этом этапе копия фрагмента гена Notch2 (обозначаемая Notch2NL) оказалась нефункциональной. Однако около трех миллионов лет назад в линии австралопитеков генная конверсия привела к восстановлению рамки считывания, а на протяжении последующей истории эволюции рода Homo произошло еще три дупликации новообразованного гена. Так образовалось семейство генов Notch2NL. Эти гены кодируют белки, очень похожие на Notch2, но секретируемые, а не встроенные в мембрану рецепторы. Работая в тканях растущего мозга, они повышают интенсивность клеточных делений клеток-предшественников нейронов и формирование более крупного мозга с более развитой корой. Выводы ученых подкрепляются давно установленной ролью мутаций типа делеций/дупликаций соответствующего участка хромосомы в развитии макроцефалии и микроцефалии у людей.

Недавно в журнале Cell одновременно были опубликованы два исследования, посвященные новооткрытым генам, сыгравшим, по-видимому, существенную роль в эволюции размера человеческого мозга. Статья большой группы ученых из преимущественно американских научных учреждений во главе с Иэном Фиддесом (Ian T. Fiddes) называется Human-Specific NOTCH2NL Genes Affect Notch Signaling and Cortical Neurogenesis. Статья их коллег из Брюссельского свободного университета во главе с Икуо Судзуки (Ikuo K. Suzuki) называется Human-Specific NOTCH2NL Genes Expand Cortical Neurogenesis through Delta/Notch Regulation. Но прежде, чем начать рассказ о новых открытиях, нужно разобраться в двух общебиологических феноменах, имеющих прямое отношение к делу.

Во-первых, рассмотрим некоторые детали процесса формирования коры головного мозга в ходе эмбрионального развития. Головной мозг образуется как расширение на переднем конце нервной трубки, у человека его формирование начинается на 3–4 неделе развития эмбриона (основные этапы развития центральной нервной системы человека хорошо показаны в этом видео). И уже на самом раннем этапе начинает формироваться будущая кора головного мозга. Схема этого процесса показана на рис. 2. Наиболее недифференцированные нейрогенные клетки располагаются в самом глубоком слое — вентрикулярной зоне (ventricular zone). Отсюда клетки перемещаются в субвентрикулярную зону (subventricular zone), где происходит их активное размножение. По мере дальнейшего продвижения в промежуточную зону и, наконец, кортикальную пластинку клетки-предшественники дифференцируются в зрелые нейроны. В коре взрослого человека шесть слоев зрелых нейронов, со специальными свойствами и функциями, но на отображенных этапах эмбрионального развития присутствуют лишь некоторые из них — на рис. 2 эти слои подписаны цифрами.

Рис. 2. Кортикогенез — развитие коры головного мозга человека. Показан мозг зародыша в возрасте 7, 8,5 и 12 недель (p.c.w.). В нижней части — гистологическая организация коры головного мозга (участок, выделенный рамкой) на соответствующих стадиях. Наиболее недифференцированные нейрогенные клетки располагаются в самом глубоком слое — вентрикулярной зоне (VZ). Отсюда клетки перемещаются в субвентрикулярную зону (SVZ), где происходит их активное размножение. По мере дальнейшего продвижения в промежуточную зону (IZ) и, наконец, кортикальную пластинку (CP) клетки-предшественники дифференцируются в зрелые нейроны. Рисунок из статьи S. K. Reilly et al., 2015. Evolutionary changes in promoter and enhancer activity during human corticogenesis

Во-вторых, следует разъяснить, что собой представляет сигнальный каскад Notch-рецепторов и каким образом он помогает определить судьбу клеток в развивающемся мозге эмбриона. Схема и пояснения на рис. 3. В этой системе есть два ключевых игрока: собственно, рецептор Notch и его лиганд (белок, специфично взаимодействующий с белком Notch). И рецептор, и лиганд представляют собой мембранные белки — это значит, что часть молекулы заякорена в мембране, часть торчит снаружи от клетки (внеклеточный домен), а еще одна часть, наоборот, обращена внутрь клетки (внутриклеточный домен). Смысл в том, что, приняв сигнал снаружи (взаимодействие с лигандом), рецептор изменяется таким образом, что сигнал передается на внутриклеточный домен, а далее каскад событий уже внутри клетки меняет ее поведение — в данном случае, направление дифференцировки (см. также видео).

Рис. 3. Принцип работы Notch-сигналинга и его роль в определении судьбы нейрогенных клеток при кортикогенезе. На клетках предшественниках экспрессируются в небольшом количестве рецепторы Notch и их лиганды, например DLL. Оба типа молекул встроены в мембрану и имеют части, выступающие наружу (внеклеточные домены) и выступающие внутрь (внутриклеточные домены). Если молекула рецептора на одной клетке соприкасается с молекулой лиганда на соседней клетке, то обе эти клетки получают сигнал, определяющий их дальнейшую судьбу. Клетка, представившая рецептор (получатель сигнала), начинает экспрессировать еще больше таких же рецепторов, а синтез лигандов в этой клетке подавляется (эти цепочка событий обозначена на рисунке как trans-activation). Такая клетка будет сохранять свойства делящейся недифференцированной клетки. Отделяемый при активации рецептора внутриклеточный домен NICD перемещается в ядро и работает там в качестве активатора транскрипции определенных генов. В то же время клетка, которая служила «сообщателем» сигнала, наоборот, начинает синтезировать еще больше лиганда, а действие рецепторов при этом блокируется (cis-inhibition); эта клетка будет дифференцироваться и мигрировать к кортикальной пластинке, такие клетки уже не делятся. Рисунок из статьи C. L. Chillakuri et al., 2012. Notch receptor–ligand binding and activation: Insights from molecular studies, с небольшими дополнениями

Вся эта система содержит одну интересную и важную хитрость: первоначально на незрелых клетках экспрессируются в небольшом числе и рецепторы, и лиганды. Но после того, как контакт двух соседних клеток произошел, сложная система обратных связей приводит к тому, что та клетка, которая вступила в контакт молекулой-рецептором (случайно), начинает синтезировать больше молекул-рецепторов, но меньше молекул-лигандов. Та же клетка, которая вступила в контакт молекулой-лигандом (тоже случайно), — наоборот, синтезирует в дальнейшем меньше молекул-рецепторов, и больше молекул-лигандов. Так две соседние клетки, изначально одинаковые, становятся разными и принимают разные направления дифференцировки. В случае нейронов та клетка, которая преимущественно представляет рецептор, сохраняет потенциал дальнейшего деления, то есть свойства незрелой клетки, а та, которая преимущественно представляет лиганд, прекращает делиться и переходит к дифференцировке в зрелый нейрон. Нужно отметить, что система Notch-сигналинга (Notch signaling pathway) имеется у всех животных и многократно задействована в дифференцировке самых разных тканей, включая, помимо мозга, мышцы, слизистую оболочку желудочно-кишечного тракта, поджелудочную железу, кроветворение и пр.

Два обсуждаемых исследования замечательно дополняют друг друга. Во-первых, они подтверждают одинаковые выводы, но используют разные методические подходы, что очень повышает градус доверия к полученным результатам. Во-вторых, каждое из них выявляет какие-то стороны функционирования системы сигналинга, которые не были рассмотрены в другой работе.

Общие итоги (совпадающие в двух работах) следующие:
    1) Гены семейства Notch2NL сформировались посредством нескольких событий внутрихромосомных дупликаций. Вся цепочка событий занимает промежуток от 8–10 млн лет назад (когда жил общий предок гориллы, шимпанзе и человека) до около 0,5 млн лет назад, когда произошла последняя дупликация в линии, ведущей непосредственно к людям. Вся история показана на рис. 4. Тут сразу нужно отметить, что участок хромосомы 1q21 (именно здесь располагаются 3 из 4 членов семейства Notch2NL) давно известен как горячая точка делеций и дупликаций в популяции людей, причем эти мутации ассоциируются с патологиями развития и работы центральной нервной системы.

Рис. 4. История эволюции семейства генов Notch2NL (А) и изменения размеров мозга в эволюции человека (В). Примерно 3–4 млн лет назад дуплицированный фрагмент гена Notch2, который был просто псевдогеном, претерпел конверсию по матрице гена Notch2 (то есть частично «скорректировался» посредством гомологичной рекомбинации с функциональным геном) и стал кодировать новый белок. На протяжении последующих нескольких миллионов лет в человеческой линии произошло образование еще трех генов-дупликатов, также кодирующих сходные белки. Параллельно шел и ускоренный рост размеров мозга. Рисунок из обсуждаемой статьи I. T. Fiddes et al. в Cell

    2) Гены Notch2NL экспрессируются в эмбриональной коре головного мозга, там же, где и ген-предшественник рецептора Notch2. Четыре гена семейства (Notch2NLA, Notch2NLB, Notch2NLC, Notch2NLR) экспрессируются неодинаково активно, распределяясь таким образом: B > A > C > R (рис. 1).
    3) В экспериментах искусственное повышение экспрессии Notch2NL (типа А и В) в клетках приводило к увеличению числа делящихся клеток и снижению числа дифференцированных клеток. Искусственное отключение этих же генов давало противоположный результат. В частности, на рис. 5, взятом из обсуждаемой статьи «американской» группы, показаны результаты работы по манипуляции с искусственными органоидами мозга, выращенными из человеческих или мышиных эмбриональных стволовых клеток. Их коллеги из Бельгии получили аналогичный результат на колониях эмбриональных клеток в культуре, а также на полноценных мышиных эмбрионах, клетки мозга которых генетически модифицировали посредством электропорации прямо в матке мышки-мамы.

Рис. 5. Эксперименты по выращиванию органоидов коры головного мозга. Органоиды выглядят как округлые многоклеточные образования, в которых середина соответствует слою с низкодифференцированными клетками (они экспрессируют белок Pax6, показанный зеленым), а края — слою с дифференцированными нейронами (маркер зрелых нейронов — CTIP2, красный). А — органоиды, полученные из стволовых клеток человека возрастом 4 и 5 недель, — именно в это время активно начинается дифференцировка нейронов. Репортерные белки позволяют увидеть клетки разной стадии дифференцировки с соответствующими маркерами. Белок TBR2 (левое верхнее фото) характерен для клеток в промежуточном состоянии дифференцировки. В — оценка экспрессии генов на 4 и 5 неделе при естественном развитии органоидов из клеток человека и органоидов, полученных из клеток с удаленными генами Notch2NLA и Notch2NLB. Цветовая линейка (голубой цвет здесь соответствует низкой экспрессии гена, желтый — высокой экспрессии гена) позволяет увидеть, что органоиды с делецией генов Notch2NL в свои 4 недели «выглядят» на все 5 недель — дифференцируются быстрее и раньше начинают экспрессировать гены, свойственные зрелым нейронам. На рисунках С и D показана разница в экспрессии генов в 6-дневных органоидах из стволовых клеток мыши, в которые, наоборот, вносили дополнительные копии генов Notch2NL. При этом снижалась экспрессия генов, характерных для зрелых нейронов, но повышалась экспрессия генов, характерных для незрелых предшественников. Е — показаны стадии роста органоидов из клеток человека: нормальных (верхний ряд фото) и с удаленными генами Notch2NL (нижний ряд). Видно, что органоиды с делецией растут гораздо медленнее, ведь рост органоидов (и коры мозга в эмбрионе) зависит от того, какая доля клеток продолжает сохранять способность к делению по ходу развития. Рисунок из обсуждаемой статьи I. T. Fiddes et al. в Cell

Теперь нужно сказать об индивидуальных заслугах авторов.

Анализ геномов нескольких сотен людей, который провела «американская» группа, показал, что у примерно 14% здоровых людей гена R просто нет, а также, что совсем небольшая доля людей обходится без гена С. Зато вот число генов А и В очень значимо: у здоровых людей их всегда в сумме 4 (обычно 2 от мамы и 2 от папы, но встречаются и варианты 3 + 1), а вот уменьшение или увеличение числа копий А + В неминуемо ведет к микроцефалии или макроцефалии. Интересно, что более тяжелые отклонения в психике (в частности, аутизм) и интеллектуальном развитии связаны как раз с увеличением числа копий генов, в то время как снижение числа копий генов отражалось главным образом в форме нарушений настроения — повышенной тревожности и т. п.

Ну и все-таки, каков же механизм выявляемого действия белков семейства Notch2NL на процессы роста и дифференцировки клеток коры головного мозга? Чтобы ответить на этот вопрос, ученые сначала сформулировали гипотезы, и придумали тест-систему для их проверки. Гипотезы, а, следовательно, и тест-системы были разные. Так или иначе, обе группы исходили из того установленного факта, что белки Notch2NL присутствуют в гиалоплазме (полужидком содержимом) клеток, в эндоплазматической сети и аппарате Гольджи, а также секретируются в межклеточное пространство.

Начнем с группы из США. Они предположили, что белки Notch2NL действуют снаружи клеток, связываясь с рецепторами Notch и активируя их тем же путем, как это делают лиганды типа DLL (рис. 6, А), тем самым оказывая дополнительное стимулирование клеток в направлении пролиферации. Связывание белков Notch и Notch2NL подтвердили иммунопреципитацией: действительно, антителами к любому из этих белков вылавливались в том числе и комплексы из связанных белков. А для того, чтобы подтвердить весь механизм, делали вот что. Обычные эпителиальные клетки в культуре (в которых не экспрессируются ни рецепторы, ни лиганды Notch) модифицировали вектором, в котором был ген Notch. Но внутриклеточный домен NICD был заменен на домен другого транскрипционного фактора, который мог активировать экспрессию гена-репортера (его продукт можно увидеть по окрашиванию клеток), также вносимого в клетки искусственно. Как вы помните (рис. 3), чтобы этот домен мог сработать, рецептор должен быть активирован через внеклеточный домен. В том же векторе вносился ген Notch2NL (вариант А или В). В контрольном векторе гена Notch2NL не было. Результат оценивали по уровню экспрессии гена-репортера. Система сработала именно так, как и рассчитывали авторы: ген репортер экспрессировался на 20–60% выше в присутствии Notch2NL. Таким образом следует вывод, что эти белки, секретируясь, могут активировать клетки, несущие на себе рецептор Notch, через их внеклеточный домен.

Рис. 6. Схемы регуляции дифференцировки нейронов коры при участии генов Notch2NL. А — механизм, показанный группой из США, В — механизм, показанный бельгийской группой. Подробные пояснения в тексте. Рисунки из обсуждаемых статей в Cell

Ученые из Бельгии рассмотрели альтернативную и не менее логичную гипотезу (рис. 6, В). Рассуждали так: белки Notch2NL очень похожи на внеклеточный домен рецептора Notch. Вполне вероятно, что они будут связываться с лигандами DLL. Проверили опять же иммунопреципитацией — да, связываются. Мы знаем, что лиганды могут связывать рецепторы Notch in cis(см. Цис-регуляторные элементы) и блокировать их работу, подталкивая тем самым клетку к дифференцировке (рис. 3). А что, если Notch2NL связывают лиганды прямо внутри клетки (еще до транспортировки рецептора к наружной мембране), препятствуя осуществлению ингибирования in cis? Опять же, ученые придумали схему для проверки. Они модифицировали клетки мозга ранних живых эмбрионов мышей (модификация электропорацией прямо в матке) векторами, которые содержали репортерный красный флуоресцирующий белок, ген DLL (в отличие от внутреннего гена DLL, экспрессия этого гена не может быть подавлена на уровне транскрипции за счет активности Notch), а также содержали или не содержали ген Notch2NL. В контрольном варианте вектор содержал только репортерный ген. Затем, спустя время, необходимое для дифференциации слоев коры, смотрели, как распределятся светящиеся клетки по зонам вдоль среза коры. Как и следовало из гипотезы авторов, при постоянной экспрессии DLL в клетках стимулировалась их дифференцировка и светящиеся клетки оказывались преимущественно в кортикальной пластинке, но если в этих же клетках синтезировался белок Notch2NL, распределение светящихся клеток становилось более близким к контролю. Следовательно, действие Notch2NL в этом эксперименте очевидно опосредовано взаимодействием этих белков с DLL.

Остается заключить, что и те, и другие авторы молодцы — выдвинули верные гипотезы, а природа молодец вдвойне — нашла возможность для обеспечения адаптивного результата сразу по двум механизмам, создав всего-то несколько дополнительных копий фрагмента уже имеющегося гена.

Любопытно, что статьи не только опубликованы рядом в одном номере одного журнала, но и поступили в редакцию с разницей в два дня. Если это было целенаправленное сотрудничество, то команды, на мой взгляд, можно только поприветствовать. Им удалось сообща получить очень интересный результат.

Источник: elementy.ru